研究成果表明，mNGS和基于多重PCR的tNGS在细菌和真菌检测方面的性能相似；在检测DNA病毒方面，tNGS可能优于mNGS。两种NGS检测方法与PCR相比没有明显差异。本次研究成果的发表，为亿万先生MR基于二代测序的病原检测产品应用，提供了坚实的研究数据支持。 论文发布截图
研究背景 肺部感染在全球范围内广泛流行，具有较高的发病率及死亡率，构成严重医疗负担。早期、准确的病原学诊断对制定针对性的抗生素治疗方案、降低病死率具有重要意义。通过检测BALF样本，可以较为便捷地诊断各种肺部疾病，包括肺部感染。 在临床上，BALF样本中病原体的鉴定主要基于传统的微生物培养、显微镜涂片和聚合酶链式反应(PCR)。 传统的微生物培养，被认为是感染性疾病病原体诊断的金标准，但它存在检测周期长，灵敏度低，检测非典型病原体、病毒和苛养微生物具有挑战性等缺点。镜检涂片的检出率同样较低，可供选择的检测靶标也较少。此外，PCR检测需要预设针对病原的特异性引物或探针，因此该方法只能检测已知病原体，在单次检测中检测病原体的能力有限。 近年来，二代测序(NGS)技术结合生物信息学已成为人类病原体检测、鉴定和分析的有力工具，为应对上述临床诊断挑战提供了新选择。 mNGS是一种不依赖培养、无需预设、无偏倚、全面的微生物检测和分类学鉴定方法，具有高灵敏度、广泛的病原体范围以及检测新出现病原体的能力，已被证明在肺部感染病原体的检测和鉴定中具有可行性。然而，mNGS仍面临诸多挑战，如成本高、人源基因干扰大、结果判读困难、无法同时进行DNA和RNA双流程检测等。 基于靶向扩增技术和高通量测序技术的tNGS应运而生。目前，tNGS似乎具有检测灵敏度不受人类基因组和背景微生物影响、检测成本更低、样本要求更低、工作流程易于标准化、可同时检测DNA和RNA病原体等优点。然而，基于多重PCR技术的tNGS在BALF样本中的病原体鉴定性能尚不清楚。
研究方法 本研究共收集85例疑似感染患者BALF样本。对每个标本均进行mNGS和tNGS工作流程，分别从样本维度、病原维度评价并比较mNGS和tNGS在病原体检测方面的性能。最后，用PCR方法对临床重点病原体的不一致鉴定结果进行验证。 研究结果
根据纳排标准，最初将来自83名患者的85份BALF样本纳入本研究。随后，2例样本未通过tNGS工作流程的QC过程。最后，83个样本被纳入进一步分析。
mNGS和tNGS病原体鉴定 mNGS和tNGS的微生物检测阳性率分别为95.18% (79/83)和92.77%(77/83)，差异无统计学意义(P =0.625)。 mNGS和tNGS病原体检测结果如图1所示，主要检测到细菌和DNA病毒。mNGS共检测到244种病原菌。细菌共31种，占检出总数的47.13% (115/244)；DNA病毒有6种，占检出总数的33.61%(82/244)；真菌15种，占18.85%(46/244)；寄生虫检出1例口腔毛滴虫，占0.41%(1/244)。 相比之下，tNGS从83份BALF样本中鉴定出270种潜在病原体。细菌共28种，占检出总数的40.00% (108/270)；DNA病毒8种，占40.74% (110/270)；RNA病毒8种，占9.26% (25/270)；共检出真菌8种，占10.00% (27/270)。
图1：mNGS和tNGS工作流程病原体鉴定结果
mNGS与tNGS结果比较 mNGS和tNGS检测病原体的一致性如图2所示。76例(91.57%，76/83)样本mNGS和tNGS检测均为阳性，3例(3.61%)两者均为阴性。76例双阳性样本中，9例mNGS与tNGS检测结果完全一致；60份样本的mNGS和tNGS检测结果部分一致，至少检测到1种相同的病原；其余7例样本mNGS与tNGS检测结果完全不一致。 因此，本研究纳入样本的mNGS和tNGS检测结果完全一致率为14.56%(12/83)，完全不一致率为13.25 %(11/83)，部分一致率为72.27%(60/83)。 图2：mNGS和tNGS检测病原体的一致性 图3比较了mNGS和tNGS检测每种类型病原、每种病原的阳性样本数量，并对不同panel范围和不同报出分类层级的病原进行了特殊标记。RNA病毒和寄生虫检出情况的差异是由不同的检测范围造成的。 对于细菌，总体阳性率差异无统计学意义。具体而言，两种工作流程均检测到的TOP3均为MTBC、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌，仅胞内分枝杆菌的检出率差异显著(P<0.05)，这是由分类学类别不同造成的。对于真菌，两种方法的TOP3真菌检出均为烟曲霉、白色念珠菌和耶氏肺孢子菌。病原体阳性率无显著差异，但由于检测范围和分类层级的差异，特定病原体检测的比例较高，导致mNGS的总体真菌阳性率显著高于tNGS(P<0.001)。 对于DNA病毒，除细环病毒不在tNGS检测范围内外，mNGS和tNGS检测到的病原谱一致，分别为人EBV、CMV、人疱疹病毒7型、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒1型。另外，EBV(P<0.001)、人疱疹病毒7型(P <0.001)、CMV(P<0.05)和人疱疹病毒6型(P<0.01)的阳性样本数量具有统计学差异，且tNGS总是具有较高的检出率，这可能反映了mNGS和tNGS之间的性能差异。 图3：mNGS和tNGS检测病原体的结果比较 核心病原验证
基于mNGS和tNGS结果，对临床核心病原体结果存在差异的BALF样本进行PCR正交验证。如图4所示，mNGS和PCR的微生物检出率均高于tNGS，但mNGS和tNGS与PCR的总符合率相同，均为50%。
图4：关键病原体mNGS和tNGS检测结果不一致的PCR分析
研究总结
本研究系统评估了mNGS和基于多重PCR的tNGS在BALF样本中的病原检测性能差异。总体而言，mNGS和tNGS在检测细菌和真菌方面性能相近，而tNGS在检测DNA病毒方面可能优于mNGS。两种NGS检测方法与PCR相比没有明显差异。亿万先生MR的研究结果为mNGS和tNGS的临床应用提供了有力的科学依据。
近年来，亿万先生MR以二代测序技术为依托，不断开拓创新，以技术力牵引产品力打造，以产品力引领科研与服务力提升，助力临床医生实现精准、快速、全面的感染性疾病诊断。未来，亿万先生MR将继续携手科研机构与医疗机构，共同推动感染性疾病诊疗进入新时代。
